肉毒素簡介

　　肉毒毒素(Botulinumneurotoxin，BoNT)是由厭氧的肉毒桿菌在生長繁殖過程中產(chǎn)生的一種細(xì)菌外毒素，它能引起死亡率極高的中毒。自古以來，倒在這種毒素下的人類生命不計(jì)其數(shù)，而且在西方尤其多見。西方人很早就發(fā)現(xiàn)，吃肉制品容易發(fā)生肉毒素中毒癥。Botulinum這個(gè)詞匯，就源自于“肉腸”的拉丁文botulus；而中文譯為“肉毒素”也是這個(gè)緣故。在分子數(shù)相同的條件下，其致死力是白喉毒素的300倍，蓖麻毒素的3萬倍，銀環(huán)蛇毒素的300萬倍，箭毒的10億倍，是目前已知的毒力最強(qiáng)的分子，被美國疾病控制預(yù)防中心(CDC)列為A級(jí)生物恐怖劑。

　　肉毒梭菌及其毒素根據(jù)毒素抗原性的不同，將其分為A、B、C、D、E、F和G七個(gè)亞型。其中A、B、E、F為人中毒型別，C、D型為動(dòng)物和家禽的中毒型別。C型肉毒梭菌在自然界廣泛分布。飲食污染有C型肉毒梭菌特別是C型肉毒毒素的水源或草料的動(dòng)物有可能發(fā)生C型肉毒中毒。動(dòng)物中毒后，20小時(shí)左右甚至幾小時(shí)內(nèi)即可致死，死亡率極高，常常來不及用抗毒素進(jìn)行特異性治療。肉毒中毒發(fā)生后，若不及時(shí)采取措施，則會(huì)引起其它食肉動(dòng)物因食用中毒動(dòng)物尸體而死亡或攜帶肉毒梭菌，造成肉毒梭菌在自然界中的傳播與潛伏，有可能引起范圍更廣、更嚴(yán)重的肉毒中毒，并危害人類健康。

　　肉毒毒素不耐熱，90℃情況下2分鐘可完全破壞；不耐堿，溶解在pH11的堿性溶液中3分鐘就可滅活。肉毒毒素溶液加0.6%的福爾馬林37℃下作用一個(gè)月以上可失去毒性，但仍保持抗原性和免疫原性，成為類毒素。肉毒素對乙醇穩(wěn)定；但可被鹵素滅活。粗制毒素較精制毒素穩(wěn)定。毒素溶液在pH6.0，4℃下保存，效價(jià)可保持半年不變。凍干毒素在低溫條件下可長期保存，毒性下降緩慢。

　　肉毒素發(fā)現(xiàn)及應(yīng)用史

　　19世紀(jì)20年代：德國醫(yī)生JustinusKerner從變質(zhì)的香腸中發(fā)現(xiàn)了一種引起食物中毒的毒素。由于Kerner的“香腸之毒”導(dǎo)致麻痹癱瘓性疾病，因而獲得了“肉毒之毒”(來源于拉丁文“botulus”)的稱號(hào)。Kerner推測，小劑量的肉毒素也許可以用于治療神經(jīng)紊亂性疾病以及多汗癥。1895年，比利時(shí)細(xì)菌學(xué)家EmilePierrevanErmengem發(fā)現(xiàn)，肉毒桿菌可以產(chǎn)生肉毒素。20世紀(jì)20年代，美國舊金山加利福尼亞大學(xué)的HermanSommer博士以穩(wěn)定的酸沉淀形式最先從肉毒桿菌中提煉出A型肉毒素。

　　20世紀(jì)40年代，第二次世界大戰(zhàn)期間，美國科學(xué)家開始探索肉毒素的潛在用途，試圖將它變成戰(zhàn)爭的武器。1949年，在英國倫敦，研究人員ArnoldBurgen博士和他的同事們發(fā)現(xiàn)，肉毒素可以阻斷神經(jīng)和肌肉的聯(lián)系。20世紀(jì)60年代，舊金山眼科醫(yī)生AlanScott將肉毒素注射入猴子體內(nèi)，觀察它們是否可以令導(dǎo)致斜視的肌肉放松下來。1978年，Scott醫(yī)生獲得了美國食品和藥物管理局(FDA)的批準(zhǔn)，進(jìn)行關(guān)于肉毒素用于治療人類斜視問題的廣泛動(dòng)態(tài)測試。他將這種藥物命名為Oculinum，并且創(chuàng)建了Oculinum公司來生產(chǎn)及出售這種藥物。1989年，Oculinum獲美國FDA批準(zhǔn)用于治療斜視及眼瞼顫動(dòng)。

　　1986年，加拿大Carruther夫婦在用肉毒桿菌毒素治療眼瞼痙攣時(shí)，意外的發(fā)現(xiàn)了其良好的除皺效果。隨后，他們相繼用肉毒素對額紋、眉間紋、魚尾紋進(jìn)行了治療，經(jīng)過了一系列嘗試，于1992年首先報(bào)道，Carruther夫婦就成了此項(xiàng)技術(shù)的發(fā)明者和先驅(qū)。2002年4月15日，肉毒素獲美國FDA批準(zhǔn)用作醫(yī)學(xué)美容材料，主要用于注射除皺，暫時(shí)性地改善中度至重度的眉間皺紋，這一重大事件無疑使肉毒素成為愛美人士的“面部救星”。時(shí)至今日，肉毒素仍然是很多愛美之人瘦臉、除皺的理想選擇。1993年，中國蘭州生物制品研究所自主研發(fā)的A型肉毒素制品——衡力問世。2006年，GSK在中國上市保妥適(BOTOX)。

　　肉毒素的作用機(jī)制

　　CrystalstructureofbotulinumneurotoxinA1(BoNT/A1)

　　肉毒素是一種蛋白類毒素。菌株細(xì)胞內(nèi)所翻譯的原初蛋白為150kDa的一條多肽鏈；隨后通過蛋白酶的作用，在跨越二硫鍵的環(huán)狀區(qū)域進(jìn)行切割，形成成熟的肉毒毒素，由50kDa的輕鏈(L鏈)及100kDa重鏈(H鏈)構(gòu)成，如上圖所示。重鏈和輕鏈之間通過一個(gè)分子內(nèi)二硫鍵及不同結(jié)構(gòu)域間的非共價(jià)相互作用而構(gòu)成三維結(jié)構(gòu)。目前科學(xué)人員已經(jīng)解析了BoNT/A1，BoNT/B1及BoNT/E1的晶體結(jié)構(gòu)。同其他作用于細(xì)胞內(nèi)靶點(diǎn)的細(xì)菌毒素類似，BoNT也由功能不同的結(jié)構(gòu)域所組成：輕鏈編碼毒性功能區(qū)，為一金屬蛋白酶活性區(qū)域，能夠特異性切割SNARE家族蛋白，后者對于神經(jīng)遞質(zhì)的分泌是必須的；HN結(jié)構(gòu)域?qū)τ谳p鏈穿越內(nèi)吞小體轉(zhuǎn)位至神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)至關(guān)重要；而HC結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)突觸前結(jié)合和內(nèi)吞，其自身由兩個(gè)不同結(jié)構(gòu)的亞結(jié)構(gòu)域所構(gòu)成。氨基酸序列的保守性及結(jié)構(gòu)分析表明：BoNT/C，BoNT/D和BoNT/G同BoNT/A及BoNT/B較為相似；而BoNT/E同BoNT/F之間相似度更高。肉毒毒素通常是由神經(jīng)毒素和血凝素組成的復(fù)合形式存在。

　　肉毒素的毒性機(jī)理主要為抑制神經(jīng)遞質(zhì)對細(xì)胞信號(hào)的傳遞過程?；瘜W(xué)突觸中的信號(hào)是由神經(jīng)遞質(zhì)介導(dǎo)的，這些神經(jīng)遞質(zhì)從突觸前神經(jīng)末梢釋放出來，并與位于突觸后細(xì)胞(如肌肉或外分泌細(xì)胞)的受體結(jié)合。神經(jīng)遞質(zhì)在神經(jīng)元胞漿中合成，并儲(chǔ)存在突觸前神經(jīng)末梢內(nèi)的小突觸小泡中。在突觸囊泡腔中神經(jīng)遞質(zhì)的積累主要是由質(zhì)子電化學(xué)梯度所驅(qū)動(dòng)，后者由ATPase質(zhì)子泵產(chǎn)生的，它位于突觸囊泡膜上并利用ATP水解釋放的能量將ATP泵入突觸小泡。突觸小泡在神經(jīng)末梢形成一個(gè)神經(jīng)遞質(zhì)的儲(chǔ)備池，并與突觸前膜成為活性區(qū)域的特定部位結(jié)合，稱為“docking”。多種蛋白分子逐步形成一個(gè)較大的復(fù)合體，來完成突觸小泡的docking過程。該復(fù)合體包括兩個(gè)突觸囊泡上的膜蛋白，VAMP(synaptobrevin)及Syt(synaptotagmin)；兩種位于突觸前膜的蛋白，SNAP25及syntaxin；以及胞漿蛋白complexin和Munc18，來參與后續(xù)步驟，即使得突觸囊泡能夠響應(yīng)鈣離子內(nèi)流的信號(hào)而快速同突觸前膜區(qū)域相融合。Syt分子同突觸前膜上的肌醇磷脂分子相互作用，而VAMP則同SNAP25及syntaxin形成coiled-coil結(jié)構(gòu)，也被稱之為SNARE復(fù)合體。Docking過程完成后，complexin同Munc18一起發(fā)揮剎車的作用而阻止融合過程的即刻發(fā)生，并促進(jìn)其他蛋白形成一個(gè)更大的超級(jí)SNARE復(fù)合體，這也是介導(dǎo)神經(jīng)遞質(zhì)釋放的最核心結(jié)構(gòu)。神經(jīng)末梢的去極化會(huì)導(dǎo)致膜上鈣離子通道的打開以及大量鈣離子的進(jìn)入，從而引發(fā)復(fù)合體的快速構(gòu)象變化，使得突觸囊泡與突觸前膜融合而將神經(jīng)遞質(zhì)釋放至突觸間隙。神經(jīng)遞質(zhì)擴(kuò)散到神經(jīng)末梢，并與突觸后受體結(jié)合，從而觸發(fā)突觸后細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)。在神經(jīng)遞質(zhì)釋放過程中，突觸囊腔瞬時(shí)對外開放，但隨后通過內(nèi)吞作用內(nèi)化入神經(jīng)末梢。神經(jīng)遞質(zhì)的胞吐和內(nèi)吞是嚴(yán)格耦合的：一個(gè)過程的抑制導(dǎo)致另一個(gè)過程的抑制。內(nèi)化和脫殼后，突觸小泡再次填充入神經(jīng)遞質(zhì)，神經(jīng)傳遞的下一個(gè)周期重新開始。