上個月，2018諾貝爾生理學或醫(yī)學獎授予了美國的JamesAllison和日本的TasukuHonjo教授，以表彰兩位及其團隊在腫瘤免疫治療上的巨大貢獻。

以PD-1單克隆抗體為代表的免疫療法，自2014年誕生以來，讓全世界都見識到了其在腫瘤治療方面的巨大潛力。一時間，國內外藥企加入了這條研發(fā)賽道，各家PD-1或初戰(zhàn)告捷或蓄勢待發(fā)。已登陸的O藥和K藥不消多說，就是處于在研階段的新藥也如恒河沙數。

面對這些如雨后春筍般涌現的同類藥物，除了臨床試驗以外，就沒有其他評價方式來幫助我們評價它們的好壞嗎？

當然不是。要知道從雜交瘤技術出現至今，治療性單克隆抗體的制備技術已經數次迭代，單抗“生來如何”基本決定了能走多遠，我們也擁有了一套通用的臨床前評估標準，可以借此對藥物在臨床上的表現作出預估。

今天咱們就以幾個國內外的PD-1抑制劑為例，來嘮嘮單抗的制備技術和臨床前特征。想講清楚這其中的故事，還得從單抗的結構說起，畢竟結構是功能的基礎嘛。

絕大多數治療性抗體都是IgG。IgG由四條肽鏈組成，兩重兩輕，每條鏈又可分為恒定區(qū)（CH/CL）與可變區(qū)（VH/VL），這就是抗體最基礎的結構了。

在這個基礎上，每個可變區(qū)內又存在三個短多肽鏈形成的互補決定區(qū)（CDR），與可變區(qū)的其他部分相比，CDR序列可變性更高。可以說可變區(qū)決定了抗體的抗原結合能力，而CDR又是核心中的核心。

抗體的結構還有另一種分法，就是可結晶片段（Fc）+抗原結合片段（Fab），這個也有用處，我們后面說

說起來抗體的結構還真是挺復雜的，不是人力可以完美仿造的。要知道，抗體的多個結構域都是相對獨立、模塊化的，每個部分的組成都在基因組中有復數的備份，特別是CDR，CDR自己可以分為V、D、J三種片段，它們的組合給了CDR超級豐富的變化，我們把這叫做VDJ重組。

這還不是最大的“殺器”。當被抗原激活，生產抗體的B細胞開始迅速增殖，它們編碼可變區(qū)的基因將會以遠超其他細胞的速度開始突變，這種名為體細胞超突變（SHM）的過程使得B細胞每一次分裂產生的后代都微妙地有所不同。隨后，輔助T細胞則會對B細胞進行進一步選擇，只有那些產生高親和力抗體的B細胞才能獲得資源存活下來，這個過程叫親和力成熟。

免疫系統(tǒng)的大智慧還有更多，咱們今天了解這些就夠了。所以說，機體內能夠以一套極其高效率的程式快速瞄準抗原生產具有足夠治療效率的抗體，這是體外“手工”優(yōu)化比不了的。

不過也好在抗體這種樂高一樣的模塊化結構，這給了我們借助科技改造它的機會。

人類對抗體的了解實在是走得太慢了。十九世紀末，才有科學家模模糊糊摸到了體液免疫的衣擺，又過了一百年，第一個單抗藥物才正式面世。不過后面的故事我們也知道，這款藥物之后，FDA9年沒敢再碰單抗，沒有別的原因，就是副作用太大了，病人消受不起。

最早的蛇毒血清其實是馬的血清，幸運的是你很難被同一種毒蛇咬兩次，單抗藥物就不一樣了，一般來說只要用了就得是持續(xù)使用。

第一個單抗藥得益于當時出現不久的雜交瘤技術，單純來說它就是一種小鼠產生的、小鼠自己的抗體，首先它不一定完美契合人類抗原，其次給人輸進去，人體也會產生針對它的抗藥抗體（ADA），好一點就是越用越沒用，壞一點再引發(fā)個超敏反應，病人性命堪憂。

從此科學家開始了從鼠到人的探索。

這里抗體的模塊化結構就派上用場了。起先科學家是把小鼠抗體的可變區(qū)揪下來，和人類抗體的恒定區(qū)連在一起，這樣生成的單抗實際上60%到70%都是人類的了，免疫原性已經大大降低了，這就是嵌合抗體的誕生。

現代的抗體制備技術已經又前進了兩步了，一是替換程度已經精細到CDR的人源化抗體，一是全人源抗體。人源化抗體已經有90%以上都是人類的了，全人源則故名思義，百分百人類，理論上幾乎不會引發(fā)不必要的免疫反應。

這里還可以教大家一個從名識類別的小訣竅。單抗們的通用名都巨老長，一眼看過去令人頭昏眼花，咱們可以把它們拆一拆。首先最末尾的mab大家肯定都曉得了，就是單抗的意思，再往前看兩個字母，這里邊就藏著大秘密。根據單抗命名法則，這倆字母如果是xi，那它就是個嵌合抗體；如果是zu，說明是一種人源化抗體；如果只有一個u，那恭喜你了，這是一款全人源抗體。

舉個例子，剛來中國不久的O藥和K藥，前者通用名nivolumab，可見是個全人源單抗，后者pembrolizumab，咱們就知道它是個人源化抗體了。

從人源化到全人源，雖說只是不到10%的差異但卻難比登天，畢竟我們不能直接免疫人體獲得抗體。

在這里科學家們選擇了兩條截然不同的道路——噬菌體展示和轉基因小鼠。前者利用了噬菌體/原核生物傳代快的優(yōu)勢，通過體外抗原抗體結合能力來篩選目標大分子；后者則是將人源抗體基因轉入小鼠體內，間接實現了“免疫人”。

這兩項技術終于把單抗的制備技術帶到了華山之巔，整個生物制劑領域有了一次飛躍，特別是后者，最早一批實現轉基因小鼠的Medarex為首個CTLA-4抑制劑和PD-1抑制劑鋪平了道路。

這兩種技術出發(fā)點都是實現全人源，不過各自的優(yōu)缺點也是很明顯。噬菌體展示技術基于大腸桿菌和噬菌體，生產速度是很快的——問題也出在這里，咱們知道蛋白不是光氨基酸序列對了就行，三維結構也很重要，而噬菌體對蛋白三維折疊的加工顯然是不如真核細胞精細的，就算后來又發(fā)展出了酵母展示技術，也是沒法和哺乳動物細胞比較。

另外，還記得咱們前面說過的B細胞的幾個大殺器嗎，這套全自動優(yōu)化流程噬菌體展示技術是代替不了的，想要得到高親和力的抗體，還需要進行更加漫長的篩選和人工改造。

轉基因小鼠技術的特點就與此完全相反了。相對來說，給小鼠建立免疫的過程會較長，但是抗體生成的大部分過程都是在體內進行的，只要抗原暴露充分，就能夠得到親和性足夠高的抗體，就不需要繁瑣的“手動”優(yōu)化了，而且這些抗體從理論上來說跟人體產生的不會有很大差別。

所以我們怎么知道一個單抗好不好？

其實在一個單抗應用在患者身上之前，我們已經能從其體外特征上大致看出它是否具有大展宏圖的潛力了。

以PD-1抑制劑為例，首先要具有能與PD-1高親和高特異性結合的可變區(qū)；其次功能上為了避免對靶細胞、也就是T細胞的毒性，應選用IgG4亞型；再次，IgG4抗體在體內會發(fā)生重鏈重組，S228P修飾能夠避免這個問題讓抗體結構更穩(wěn)定；最后，單抗的制備方法、也就是單抗來源，一定程度上能夠說明它可能具有的免疫原性。（點這里復習誕生記）

在結構的基礎上，單抗在臨床前實驗中表現出的親和力、特異性、免疫原性、Fc段特征和功能性，這些就是我們評估單抗綜合實力的數據指標了。

抗體依賴與抗原的特異性結合發(fā)揮作用，最理想的情況肯定是每個抗體都能夠百分百結合抗原，發(fā)揮最大效能。以一當百喜聞樂見，以百當一就有點說不過去了對不對。單抗的親和力到底有多強，直接影響到了藥物效果、臨床的最佳劑量和部分副作用程度。

單抗的親和力看的主要是兩個指標，EC50和IC50。

EC50指的是半數效應濃度，指的是藥物在引起50%最大效應變化時的濃度；IC50指的是半數抑制濃度，指的是某種抑制劑實現最大抑制效果50%時的濃度。在PD-1抑制劑這里呢，EC50和IC50關系到藥物與PD-1的結合能力和抑制PD-1與PD-L1/2結合能力。

說得更通俗一些，這倆數值越小、抗體的親和力越高，那么臨床達標的最佳劑量就可能更低，副作用可能更小。

單抗藥物最大的優(yōu)點，就是當年PaulEhrlich提到的“魔法子彈”，只針對標靶絕不誤傷正常組織，一個讓打誰就只打誰的單抗才是好單抗。這一點可以通過免疫組化分析，來確定抗體是否對正常組織“出手”。

在今天涉及的四種藥物中，只有nivolumab對于其特異性作了詳細披露。原則上nivolumab特異性結合PD-1，不與其他免疫球蛋白超家族成員，例如CD28、CTLA-4等發(fā)生作用，研究者們通過免疫組化在多個人類組織中證實了這一點。從結果來看，包括心、肝、肺、腎、脾、小腦等在內的多個組織都未出現特異性染色，只有垂體在20倍抗體濃度下表現出了低免疫活性，不過該組織并未檢出PD-1表達。

從某個角度來說，單抗本身也可以被免疫系統(tǒng)當作是一種抗原，具有免疫原性，免疫系統(tǒng)有可能會產生抗藥物抗體（ADA）。

這顯然不是我們愿意看到的，一是ADA會加速單抗藥物的清除，這意味著第一次使用有效的藥量很可能第二次就不夠用了，必須不斷增加使用量或頻次，直到最后完全沒用；二是如果免疫原性過強，很容易激起機體的過度免疫反應，帶來一系列副作用——可比打不過感冒病毒發(fā)燒流鼻涕嚴重多了。

ADA也和我們體內的其他抗體一樣分為好幾類，其中對藥效影響最大的就是中和抗體。

從臨床數據來看，CA209066研究中107位患者中僅有6位（5.6%）患者出現ADA，其中未檢測出中和抗體；綜合6項臨床研究的數據，也僅有0.3%的患者持續(xù)表現出ADA陽性。而且無論ADA還是中和抗體，它們的存在都與超敏反應、輸注反應或藥物失效無關，可以認為nivolumab在臨床上是沒有免疫原性的。

另一方面，pembrolizumab臨床試驗中1289名患者有26名（2.01%）出現ADA，這26位患者中有4位進行了中和抗體檢測，顯示1位中和抗體陽性。

不過免疫原性在臨床上受到藥物本身、儲存方法、患者條件、檢測方法等多因素影響，這方面很難直接對比。

對PD-1抑制劑來說，對Fc段的要求有些特別。大部分治療性單抗的目的都是結合抗原抓住致病原，誘導免疫細胞殺敵，前者通過CDR的特異性識別實現，后者則是通過Fc段結合免疫細胞實現的。但是PD-1抑制劑不同的點在于，它結合的標靶PD-1是位于T細胞上的，但PD-1抑制劑可不是來消滅T細胞的。

于是，為了避免同類相殘的慘劇，PD-1抑制劑的制備選用的大都是IgG4型抗體。這個亞型很溫柔，其天然的抗體依賴的細胞毒性（ADCC）很弱，補體依賴的細胞毒性（CDC）也幾乎沒有，如果再加以一些修飾能夠去除這兩大項作用就更加完美了。是否有ADCC和CDC存在，也是衡量PD-1單抗效果的指標之一。

Fc段特征在評價PD-1單抗方面還是很重要的，會直接影響到T細胞的工作效率or存亡與否。

PD-1抑制劑的最終目的是解放T細胞的潛能、讓它去殺癌細胞。在這一點上，一方面IFN、IL等細胞因子的釋放已經被證實與T細胞激活有關，另一方面，觀察實驗動物體內腫瘤的生長情況也是很好的選擇。我們不妨對已披露數據一探究竟。

對健康供者細胞進行的實驗證實，在有抗原刺激的條件下，低濃度的nivolumab就能夠顯著增加T細胞的增殖，并促進IFN-γ和IL-2的釋放，同時并不會導致非特異性淋巴細胞的激活。

JS-001的功能實驗顯示其能有效刺激T細胞增殖和IFN-γ、TNF-α釋放，同時還與nivolumab進行了橫向比較?？梢奐S-001功能性與劑量相關性更大，較高劑量時細胞因子水平更高；而nivolumab的發(fā)揮更“穩(wěn)定”，極低劑量也能達到一定效果。

功能性實驗可以說是對前述體外特征的進一步驗證。

總的來說，單抗藥物的結構設計是決定其功能效應的先決條件。面對一款PD-1單抗，我們只有把牢其最基本的評價原則——從親和性、特異性、免疫原性、Fc段特征入手，結合其在功能性實驗上的表現，才能初步判斷它是否具有一飛沖天的潛力。

這些特征在臨床上也是能被進一步證實的，比如nivolumab的臨床數據顯示，nivolumab與PD-1的結合似乎不依賴于劑量，首次用藥后4-24小時即出現平均峰值85%，這與nivolumab在體外表現出的高親和性是一致的。

追本溯源，回歸原點。只有從最開始了解PD-1單抗的臨床前特征，才能幫助我們真正慧眼識英雄。