Yescarta和Kymriah的接連批準(zhǔn)，讓基于修飾免疫細(xì)胞的新型治療手段正式走入臨床。不過(guò)兩款藥物商業(yè)化不久，卻也出現(xiàn)了些許“供不應(yīng)求”的尷尬。

CAR-T細(xì)胞的生產(chǎn)跟不上患者的需求，其中不可忽視的就是，艱難而漫長(zhǎng)的病毒轉(zhuǎn)染介導(dǎo)的基因編輯過(guò)程。

近期，《自然》雜志發(fā)表了加州大學(xué)舊金山分校研究者的最新研究成果，他們開(kāi)發(fā)出了一種基于電穿孔技術(shù)的CRISPR/Cas9遞送系統(tǒng)，無(wú)需病毒轉(zhuǎn)染，更加快速、安全，成本也更低。利用這種技術(shù)，研究者成功修復(fù)了單基因突變患者的缺陷細(xì)胞，也成功向T細(xì)胞中轉(zhuǎn)入大于1kb的DNA序列、制造出對(duì)黑色素瘤細(xì)胞靶向性更強(qiáng)的TCR-T細(xì)胞，并且在體內(nèi)表現(xiàn)出更好的抗癌效果。[1]

如果使用這種新技術(shù)，對(duì)T細(xì)胞的基因修飾可以在一周左右完成，比一般的基因編輯方法要快得多！

在重新編輯T細(xì)胞這個(gè)方向上，科學(xué)家們已經(jīng)花費(fèi)了幾十年的時(shí)光，目前使用得最廣泛、效率最高的技術(shù)手段就是利用病毒搭載基因編輯工具。不過(guò)呢，病毒載體也有它的缺點(diǎn)，比如尋找合適的病毒載體并不容易，可能需要很長(zhǎng)時(shí)間來(lái)匹配，這期間也會(huì)消耗很多經(jīng)濟(jì)成本；而且雖然風(fēng)險(xiǎn)不大，病毒載體本身還有破壞正常基因序列的可能的[2,3]。

電穿孔這項(xiàng)技術(shù)，奇點(diǎn)糕記得自己是第一次在高中生物書(shū)上看到的，電穿孔促進(jìn)體細(xì)胞融合嘛。理論上來(lái)說(shuō)，施加適當(dāng)?shù)碾妶?chǎng)能夠增加細(xì)胞膜的通透性，讓Cas9酶、DNA片段和其他需要的原件進(jìn)入細(xì)胞，這樣就可以不用病毒把基因編輯“剪刀”送進(jìn)細(xì)胞了！

可是說(shuō)起來(lái)容易做起來(lái)很難。本篇論文的第一作者TheodoreRoth博士在摸索條件上花費(fèi)了整整一年時(shí)間。Cas9蛋白和DNA的比例、培養(yǎng)細(xì)胞的方式、細(xì)胞的數(shù)量、電場(chǎng)的模式和強(qiáng)度，Roth博士嘗試了數(shù)千個(gè)條件，終于找到了能夠?qū)腴L(zhǎng)DNA序列同時(shí)，又讓細(xì)胞保持健康活力的條件。

研究者嘗試?yán)眠@種方法，向T細(xì)胞中轉(zhuǎn)入標(biāo)記了綠色熒光蛋白的“管家基因”RAB11A，結(jié)果顯示50%的細(xì)胞都出現(xiàn)了綠色熒光，可見(jiàn)這些細(xì)胞都被成功編輯了！研究者還嘗試了其他幾種靶向基因，也都成功了。

這種技術(shù)還有個(gè)優(yōu)勢(shì)，就是它“不挑剔”，新鮮提取的T細(xì)胞也可以，冷凍保存的T細(xì)胞也可以，還有一些其他臨床上可能遇到的T細(xì)胞形態(tài)，都是可以正常應(yīng)用的。

那么這種技術(shù)應(yīng)用到現(xiàn)實(shí)的臨床治療場(chǎng)景會(huì)如何呢？

研究者首先找到了一個(gè)家系的三個(gè)后代，他們都患有因IL2RA基因功能缺失突變導(dǎo)致的自身免疫疾病[4]。IL2RA是白介素2受體的關(guān)鍵組成部分，也是部分T細(xì)胞正常發(fā)育的關(guān)鍵[5]。

從這三位患者體內(nèi)取出的細(xì)胞呈現(xiàn)兩種不同的突變，一種是單堿基突變，一種是移碼突變。對(duì)前者，需要“剪去”錯(cuò)誤序列插入正確序列；對(duì)后者，替換正確序列可以，直接剪掉錯(cuò)誤序列也可以。

對(duì)這兩種突變，電穿孔CRISPR編輯都成功地“修正”了細(xì)胞的缺陷，施加IL-2刺激后表現(xiàn)得與正常細(xì)胞一樣！

當(dāng)然，修復(fù)基因突變并不是唯一的用處，文章開(kāi)頭提到的CAR-T細(xì)胞也是利用基因編輯技術(shù)修飾T細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)更好的抗癌效果。研究者想，也可以給T細(xì)胞“加點(diǎn)料”，讓它們能夠更好地識(shí)別癌細(xì)胞。

于是研究者往來(lái)自健康志愿者的T細(xì)胞中，轉(zhuǎn)入了一套特異性識(shí)別黑色素瘤細(xì)胞的TCR序列（1G4）[6]。當(dāng)研究者把修飾好的T細(xì)胞和兩種黑色素瘤細(xì)胞共培養(yǎng)，T細(xì)胞立刻特異性產(chǎn)生了大量的IFN、TNF等細(xì)胞因子。

而且，電穿孔介導(dǎo)的基因編輯，與病毒轉(zhuǎn)染介導(dǎo)的基因編輯效果相對(duì)一致，編輯后細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子水平也差不多，在體外對(duì)癌細(xì)胞的殺傷能力也都一樣強(qiáng)！

最后，研究者還嘗試在小鼠體內(nèi)模擬了整個(gè)細(xì)胞治療過(guò)程。取健康人的T細(xì)胞、體外擴(kuò)增、修飾、再輸入患癌小鼠體內(nèi)。

這批修飾過(guò)的T細(xì)胞明顯更集中在患處、更持久、也表現(xiàn)出更強(qiáng)的增殖能力。從腫瘤增長(zhǎng)速度來(lái)看，得到經(jīng)過(guò)電穿孔CRISPR修飾的T細(xì)胞治療的小鼠腫瘤增長(zhǎng)更慢，差不多只有對(duì)照組小鼠的一半，此外也比慢病毒轉(zhuǎn)染的T細(xì)胞抗癌能力更強(qiáng)！

電穿孔CRISPR技術(shù)的整個(gè)修飾流程只需要大約一個(gè)星期，這期間完成gRNA和DNA序列的設(shè)計(jì)和合成，并完成整個(gè)修飾過(guò)程。

舊金山Park癌癥免疫研究所的副所長(zhǎng)FredRamsdell說(shuō)，“以前完成免疫細(xì)胞修飾可能需要幾個(gè)月甚至一年，現(xiàn)在或許只要兩個(gè)星期。如果你是患者，你就會(huì)知道，幾周和幾個(gè)月有本質(zhì)上的差別。”[7]

除此之外，不使用病毒轉(zhuǎn)染，一方面降低風(fēng)險(xiǎn)，另一方面還能降低成本。

這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)在Marson教授自己的實(shí)驗(yàn)室中得到了廣泛的應(yīng)用，一些以前由于病毒載體導(dǎo)致的很困難、或者很昂貴的實(shí)驗(yàn)思路，現(xiàn)在已經(jīng)變得觸手可及。而整個(gè)流程的快速方便，使實(shí)驗(yàn)進(jìn)展加速到原來(lái)的好幾倍。

研究者們還認(rèn)為，這種技術(shù)可以用在更加廣泛的領(lǐng)域，比如識(shí)別感染、抑制自身免疫疾病中出現(xiàn)的過(guò)度免疫反應(yīng)，甚至治療HIV感染。[8]

可以期待研究者繼續(xù)尋找將更長(zhǎng)DNA序列轉(zhuǎn)入細(xì)胞的方法，那時(shí)，制作CAR-T細(xì)胞也將不再像今天這么困難了！