免疫印跡技術(shù)概述

免疫印跡法是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，然后利用抗體進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)已知表達(dá)蛋白，可用相應(yīng)抗體作為一抗進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)新基因的表達(dá)產(chǎn)物，可通過(guò)融合部分的抗體檢測(cè), 具有分析容量大、敏感度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，是檢測(cè)蛋白質(zhì)特性、表達(dá)與分布的一種最常用的方法，如組織抗原的定性定量檢測(cè)、多肽分子的質(zhì)量測(cè)定及病毒的抗體或抗原檢測(cè)等。 

• 檢查部位 其他
• 科室 內(nèi)科
• 相關(guān)疾病 格斯特曼綜合征 小兒幽門(mén)螺桿菌感染 泌尿生殖系真菌病 老年人支原體肺炎 丁型病毒性肝炎
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• 相關(guān)癥狀

免疫印跡技術(shù)正常值

• 無(wú)特殊顯色反應(yīng)。 

免疫印跡技術(shù)臨床意義

• 異常結(jié)果：有特殊顯色反應(yīng)，證明有某種蛋白質(zhì)存在。
  需要檢查人群：檢查某種蛋白。 

免疫印跡技術(shù)檢查方法

• (一)蛋白質(zhì)樣品獲得：細(xì)菌誘導(dǎo)表達(dá)后，可通過(guò)電泳上樣緩沖液直接裂解細(xì)胞，真核細(xì)胞加勻漿緩沖液，機(jī)械或超聲波室溫勻漿0.5-1min。然后4℃，13,000g離心15min。取上清液作為樣品。
  (二)電泳：制備電泳凝膠，進(jìn)行SDS-PAGE。
  (三)轉(zhuǎn)移：(半干式轉(zhuǎn)移)
  1、電泳結(jié)束后將膠條割至合適大小，用轉(zhuǎn)膜緩沖液平衡，5min×3次。
  2、膜處理：預(yù)先裁好與膠條同樣大小的濾紙和NC膜，浸入轉(zhuǎn)膜緩沖液中10min。
  3、轉(zhuǎn)膜：轉(zhuǎn)膜裝置從下至上依次按陽(yáng)極碳板、24層濾紙、NC膜、凝膠、24層濾紙、陰極碳板的順序放好，濾紙、凝膠、NC膜精確對(duì)齊，每一步去除氣泡，上壓500g重物，將碳板上多余的液體吸干。接通電源,恒流1mA/cm2，轉(zhuǎn)移1.5hr。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，斷開(kāi)電源將膜取出,割取待測(cè)膜條做免疫印跡。將有蛋白標(biāo)準(zhǔn)的條帶染色，放入膜染色液中50s后，在50%甲醇中多次脫色，至背景清晰，然后用雙蒸水洗，風(fēng)干夾于兩層濾紙中保存，留與顯色結(jié)果作對(duì)比。
  (四)免疫反應(yīng)：
  1、用0.01M PBS洗膜，5min ×3次。
  2、加入包被液，平穩(wěn)搖動(dòng)，室溫2hr。
  3、棄包被液，用0.01M PBS洗膜，5min×3次。
  4、加入一抗(按合適稀釋比例用0.01M PBS稀釋?zhuān)后w必須覆蓋膜的全部)，4℃ 放置12hr以上。陰性對(duì)照，以1%BSA取代一抗，其余步驟與實(shí)驗(yàn)組相同。
  5、棄一抗和1%BSA，用0.01M PBS分別洗膜，5min×4次。
  6、加入辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的二抗(按合適稀釋比例用0.01M PBS稀釋)，平穩(wěn)搖動(dòng)，室溫2hr。
  7、棄二抗，用0.01M PBS洗膜，5min×4次。
  8、加入顯色液，避光顯色至出現(xiàn)條帶時(shí)放入雙蒸水中終止反應(yīng)。 

免疫印跡技術(shù)注意事項(xiàng)

• 檢查時(shí)禁忌：無(wú)。
  檢查時(shí)禁忌：
  1、一抗、二抗的稀釋度、作用時(shí)間和溫度對(duì)不同的蛋白要經(jīng)過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳條件。
  2、顯色液必須新鮮配置使用，最后加入H2O2。
  3、DAB有致癌的潛在可能，操作時(shí)要小心仔細(xì)。