【綜述】EB病毒相關(guān)疾病免疫治療的研究進(jìn)展！

　　EB病毒(Epstein－Barrvirus，EBV)是屬于人皰疹病毒γ亞科的DNA病毒，可侵襲宿主的B淋巴細(xì)胞以及T細(xì)胞和NK細(xì)胞[1]。EBV感染在全球范圍內(nèi)普遍存在，約90%以上的成年人EBV抗體檢測(cè)呈陽(yáng)性，其主要通過(guò)唾液傳播，也可經(jīng)輸血傳染[1]。EBV感染可導(dǎo)致各種淋巴細(xì)胞增殖性疾病，包括非腫瘤性增殖性疾病和腫瘤性疾病，前者包括傳染性單核細(xì)胞增多癥(infectiousmononucleosis，IM)、慢性活動(dòng)性EBV感染(chronicactiveEpstein－Barrvirusinfection，CAEBV)、EBV相關(guān)噬血細(xì)胞性淋巴組織細(xì)胞增生癥(Epstein－Barrvirus－relatedhemophagocyticlymphohistiocytosis，EBV－HLH)；后者包括Burkitt‘s淋巴瘤(Burkitt’slymphoma，BL)、霍奇金淋巴瘤(hodgkinlymphoma，HL)、非霍奇金淋巴瘤(non－h(huán)odgkinlymphoma，NHL)、鼻咽癌(nasopharyngealcarcinoma，NPC)等，以及免疫缺陷患者感染EBV后多發(fā)的淋巴組織增殖性疾病(lymphoproliferativedisease，LPD)[1，2]。以上EBV相關(guān)疾病除IM病死率極低、預(yù)后良好外，其他類(lèi)型疾病多為惡性腫瘤，預(yù)后極差、治療困難。傳統(tǒng)的手術(shù)、化療、放療對(duì)這類(lèi)惡性腫瘤療效不佳且導(dǎo)致嚴(yán)重的不良反應(yīng)，因此尋找新的治療策略成為當(dāng)務(wù)之急。近年來(lái)，隨著對(duì)人體免疫系統(tǒng)與EBV之間的相互關(guān)系的深入研究，促使免疫療法在治療EBV相關(guān)疾病中的廣泛應(yīng)用。本文將對(duì)目前國(guó)內(nèi)外針對(duì)EBV相關(guān)疾病的免疫療法的發(fā)展以及應(yīng)用現(xiàn)狀進(jìn)行綜述。

　　一、抗體治療

　　目前，抗人CD20單克隆抗體利妥昔單抗(Rituximab)廣泛用于治療B淋巴細(xì)胞相關(guān)的LPD，成為治療CD20陽(yáng)性淋巴瘤的一線(xiàn)用藥，其在移植后EBV相關(guān)淋巴增殖性疾病(EBV－LPD)中的療效可達(dá)到63%[3]。利妥昔單抗的作用機(jī)制主要是通過(guò)Fab結(jié)構(gòu)區(qū)與B淋巴細(xì)胞上的CD20抗原結(jié)合，隨后通過(guò)補(bǔ)體－依賴(lài)細(xì)胞毒性和抗體－依賴(lài)細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒性作用導(dǎo)致B淋巴細(xì)胞溶解，因此可以將處于異常增殖的B淋巴細(xì)胞，以及被EBV感染的B淋巴細(xì)胞從體內(nèi)清除。但它同時(shí)也會(huì)損傷表達(dá)CD20的正常B淋巴細(xì)胞；利妥昔單抗對(duì)T細(xì)胞淋巴瘤以及CD20突變腫瘤的治療效果不佳[3]。另外，經(jīng)利妥昔單抗治療后患者無(wú)法恢復(fù)正常的免疫功能、出現(xiàn)疾病易復(fù)發(fā)和引起致命性病毒感染等情況[3，4]。近年來(lái)，CD20單抗丟失的病例在經(jīng)利妥昔單抗治療后多有報(bào)道，其中涉及的機(jī)制包括細(xì)胞內(nèi)吞(internalization)和胞啃(trogocytosis)作用[5，6]。CD20單抗丟失可能也是利妥昔單抗在一些患者中出現(xiàn)療效不理想以及導(dǎo)致病情反復(fù)的重要潛在因素之一[6，7]。

　　一種新的經(jīng)糖化修飾后的人源化抗CD20單克隆抗體Obinutuzumab，最近已完成相關(guān)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床Ⅰ或Ⅱ期研究，顯示出比利妥昔單抗更強(qiáng)的抗腫瘤活性，且耐受性良好[8，9]。另外，人源化抗CD52單抗(Alemtuzumab，阿侖單抗)和人源化抗CD22單抗(Epratuzumab，依帕珠單抗)的有效性在一些小規(guī)模研究和個(gè)案報(bào)道中亦得到證實(shí)，如針對(duì)利妥昔單抗耐藥、復(fù)發(fā)難治的彌散性大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuselargeBcelllymphoma，DLBCL)[10，11]。

　　二、造血干細(xì)胞移植

　　移植非親屬的臍帶造血干細(xì)胞，已有成功治療CAEBV的病例報(bào)道，適用于對(duì)化療敏感或者無(wú)合適HLA配型的骨髓干細(xì)胞移植的患者[12，13]。同種基因外周血或骨髓干細(xì)胞移植可作為先天性免疫缺陷綜合征的患者的最終治療方案。近年來(lái)，造血干細(xì)胞移植可有效降低患者體內(nèi)的病毒載量、建立正常的抗EBV免疫反應(yīng)，目前被認(rèn)為是有可能治愈CAEBV的有效策略之一[14]。EBV－HLH的患兒血清中EBV復(fù)制水平顯著高于EBV感染引起的IM患兒，所以在治療EBV－HLH的患兒時(shí)應(yīng)用HLH－94方案或HLH－2004方案的同時(shí)，需要進(jìn)行抗病毒治療。有條件可進(jìn)行干細(xì)胞移植或免疫治療[15，16]。

　　三、細(xì)胞免疫治療

　　病毒相關(guān)抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxicTlymphocytes，CTL)在保護(hù)機(jī)體免受病毒感染，以及殺傷和清除受病毒感染的宿主細(xì)胞、病毒誘導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。因此通過(guò)過(guò)繼輸注來(lái)自異體或者自體的淋巴細(xì)胞，在短時(shí)間內(nèi)重建或者修復(fù)患者體內(nèi)特異性免疫應(yīng)答能力已成為一種新的且行之有效的抗病毒及病毒相關(guān)腫瘤的治療方案[17]。目前常用獲取特異性CTL的途徑包括：從供者外周血單個(gè)核細(xì)胞中直接分選特異性CTL、在體外直接誘導(dǎo)制備特異性CTL以及建立第三方CTL庫(kù)。

　　1．供者淋巴細(xì)胞輸注(donorlymphocyteinfusions，DLI)：

　　由于約90%的人都攜帶有EBV，因此在大部分人外周血單個(gè)核細(xì)胞中都存在EBV特異性CTL。將EBV血清反應(yīng)為陽(yáng)性的供者來(lái)源的病毒特異性淋巴細(xì)胞分離后，直接輸注給患者是治療EBV感染相關(guān)疾病的有效方法[18]。但是，由于DLI移植物中含有大量的異體反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞會(huì)引發(fā)嚴(yán)重乃至致命的移植物抗宿主病(graftversushostdisease，GVHD)，這種治療手段在臨床上已逐漸被其他方法所取代[18]。由于妊娠時(shí)期母親和胎兒間的雙向血流交換，可以在母親和孩子體內(nèi)長(zhǎng)期形成母子微嵌合體(fetal－maternalmicrochimerism)可能誘導(dǎo)母子特異的免疫耐受。最近，有報(bào)道應(yīng)用大劑量HLA半相合的，來(lái)源于母親的淋巴細(xì)胞治療5例患有EBV相關(guān)T淋巴細(xì)胞增殖癥的患兒。接受細(xì)胞過(guò)繼輸注1周后，3例患兒臨床癥狀明顯緩解，2例患兒的癥狀得到部分緩解，且無(wú)1例發(fā)生明顯的GVHD[19]。

　　2．EBV特異性CTL輸注：

　　為制備大量EBV特異性CTL用于治療患者，目前常用類(lèi)淋巴母樣細(xì)胞系(lymphoblastoidcellline，LCL)作為抗原提呈細(xì)胞在體外誘導(dǎo)擴(kuò)增EBV特異性CTL的產(chǎn)生[17]。Heslop等[20]使用該方法制備EBV－CTL用于預(yù)防和治療EBV相關(guān)的淋巴細(xì)胞增殖癥，并對(duì)該治療方案的長(zhǎng)期性、有效性以及安全性進(jìn)行了全面的評(píng)估。在101例接受預(yù)防性治療的患者中，無(wú)一例發(fā)生LPD；13例接受治療性輸注的患者中，11例達(dá)到完全緩解，在所有全部接受治療的患者中無(wú)GVHD個(gè)案的發(fā)生。更為重要的是，對(duì)比嵌合抗原T細(xì)胞(chimericantigenreceptorTcells，CART)治療方案，EBV－CTL輸注不會(huì)導(dǎo)致“細(xì)胞因子風(fēng)暴”(cytokinestorm)的產(chǎn)生[21]。經(jīng)過(guò)近十年來(lái)的臨床試驗(yàn)，使用LCL制備的EBV－CTL具有良好的治療效果和安全性，目前已成為經(jīng)典的制備EBV－CTL方法。但這種方法也有其局限性，例如產(chǎn)生的特異性CTL主要是針對(duì)Ⅲ型潛伏感染相關(guān)的惡性疾病。另外，制備的流程較為復(fù)雜，制備時(shí)間過(guò)長(zhǎng)(約10周)。因此，針對(duì)性的改造LCL，使其表達(dá)潛伏膜蛋白(LMP)等非優(yōu)勢(shì)抗原表位，或者利用其他經(jīng)過(guò)基因工程改造的細(xì)胞，如K562細(xì)胞，制備特異性的EBV－CTL，進(jìn)而治療Ⅱ型潛伏感染相關(guān)的惡性疾病，如NPC和HL[21]。例如，Bollard等[22]用過(guò)表達(dá)LMP蛋白的LCL制備獲得的EBV－CTL治療Ⅱ型潛伏感染相關(guān)的HL和NHL取得一定的療效，21例患者中，13例獲得臨床響應(yīng)，其中11例是完全響應(yīng)。另外，樹(shù)突細(xì)胞(dendriticcell，DC)也被做為抗原提呈細(xì)胞用于制備EBV－CTL，例如，利用DC負(fù)載EBV相關(guān)的抗原多肽或者將抗原基因轉(zhuǎn)染至DC，從而提高誘導(dǎo)EBV－CTL的效率、縮短制備時(shí)間，以及獲得具有高度活化和殺傷活性的特異性CTL細(xì)胞[23，24]。為了提高篩選特異性CTL的效率，HLA－肽多聚體分離法和γ干擾素捕獲法目前也有臨床應(yīng)用的案例[17]。但是限于需要大量外周血單個(gè)核細(xì)胞用于篩選，以及成本較為昂貴等條件限制，目前還未廣泛應(yīng)用于臨床試驗(yàn)。結(jié)合免疫檢測(cè)點(diǎn)抑制劑(immunecheckpointinhibitor)，例如抗PD－1、抗PD－L1以及抗CTLA－4抗體藥物，是否可以提高EBV－CTL在體內(nèi)的治療效果，也是未來(lái)值得關(guān)注的一個(gè)問(wèn)題。

　　3．第三方CTL庫(kù)(third－partyCTL)：

　　第三方CTL庫(kù)主要是利用第三方供者來(lái)源的外周血單個(gè)核細(xì)胞，從中分離EBV特異性的CTL或者在體外進(jìn)行擴(kuò)增后，制備成相應(yīng)的CTL細(xì)胞系，隨之用多個(gè)不同供者來(lái)源的CTL細(xì)胞系構(gòu)建成CTL庫(kù)?；颊哌M(jìn)行HLA配型后，選取合適的CTL細(xì)胞系進(jìn)行輸注治療[21]。Haque等[25]利用第三方CTL庫(kù)開(kāi)展了HLA部分相合的CTL治療移植后LPD的前期臨床試驗(yàn)。Barker等[26]應(yīng)用CTL庫(kù)治療了2例臍帶血移植后出現(xiàn)的LPD，2例都得到完全緩解并沒(méi)有觀(guān)察到GVHD。Leen等[27]構(gòu)建抗EBV、巨細(xì)胞病毒(CMV)和腺病毒(Adv)三種病毒的CTL庫(kù)，并應(yīng)用于移植后發(fā)生EBV、CMV和Adv感染的50例患者中，總有效率達(dá)到74%，其中對(duì)EBV感染的有效率為67%。在該項(xiàng)試驗(yàn)中，研究者觀(guān)察到如供者CTL與患者之間HLA匹配程度越高，治療效果越好[27]。第三方CTL庫(kù)為治療EBV相關(guān)疾病提供了新的途徑，省卻了制備和鑒定的時(shí)間，經(jīng)過(guò)HLA匹配后可以直接用于臨床治療。但是，該方案的治療效果，尤其是安全性，例如如何選擇合適的第三方供者、HLA匹配的標(biāo)準(zhǔn)以及CTL制備和儲(chǔ)存流程的標(biāo)準(zhǔn)化都是未來(lái)需要進(jìn)一步確認(rèn)和解決的關(guān)鍵問(wèn)題。

　　4．γδ－T細(xì)胞：

　　Vγ9Vδ2－T細(xì)胞具有MHC非限制性的細(xì)胞殺傷活性，且可以廣泛的識(shí)別腫瘤細(xì)胞，因此這群細(xì)胞已被積極地作為腫瘤生物治療的重要細(xì)胞而在臨床上得到廣泛應(yīng)用，且已在多種晚期實(shí)體瘤的臨床試驗(yàn)中顯示出了較好的安全性與療效[28]。我們?cè)隗w外通過(guò)帕米膦酸二鈉(Pamidronate，一種在臨床上應(yīng)用于治療骨質(zhì)疏松癥的磷酸類(lèi)藥物)短時(shí)間大量擴(kuò)增并激活Vγ9Vδ2－T細(xì)胞，并觀(guān)察到這些細(xì)胞可以針對(duì)性的殺死被EBV轉(zhuǎn)化的自體B淋巴細(xì)胞，而不影響正常B淋巴細(xì)胞的活性。在人源化小鼠模型中，我們觀(guān)察到Pamidronate能通過(guò)特異性的擴(kuò)增Vγ9Vδ2－T細(xì)胞，有效地控制LPD在體內(nèi)的發(fā)展及惡化程度。上述研究提示，注射Pamidronate以及Vγ9Vδ2－T細(xì)胞過(guò)繼輸注可作為一種治療EB病毒相關(guān)B淋巴細(xì)胞異常增殖性疾病的有效手段[29]，NEnglJMed專(zhuān)門(mén)撰文點(diǎn)評(píng)本研究與發(fā)現(xiàn)，并稱(chēng)此為治療LPD提供了新的思路與途徑[30]。由于Pamidronate的安全性早已得到臨床驗(yàn)證，此次“舊藥新用”為臨床醫(yī)生以及患者提供了一條現(xiàn)成以及安全有效的對(duì)抗EB病毒相關(guān)惡性疾病的策略與治療方案。同時(shí)也具備了把生物醫(yī)學(xué)研究成果，從動(dòng)物模型直接轉(zhuǎn)化并應(yīng)用到人類(lèi)患者身上的前景。

　　四、疫苗

　　利用疫苗對(duì)EBV相關(guān)疾病進(jìn)行預(yù)防和治療一直是研究的熱點(diǎn)。其中預(yù)防性疫苗主要是以病毒包膜糖蛋白gp350為靶點(diǎn)，接種后可以通過(guò)刺激機(jī)體體液免疫產(chǎn)生中和性抗體從而阻斷病毒感染宿主細(xì)胞的通路。有學(xué)者開(kāi)展了以重組gp350疫苗為研究對(duì)象的小型Ⅱ期臨床研究，結(jié)果顯示該疫苗不能有效預(yù)防無(wú)癥狀的EBV感染，但是可以顯著降低接種者中IM的發(fā)生率。目前，已開(kāi)始Ⅲ期臨床試驗(yàn)的前期準(zhǔn)備工作[31，32]。Rees等[33]制備出一種基于gp350的疫苗，通過(guò)Ⅰ期臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)可以降低無(wú)EBV過(guò)往感染史的兒童在器官移植后產(chǎn)生LPD的風(fēng)險(xiǎn)。治療性疫苗則主要是以EBV核抗原(EBNA)和LMP為靶點(diǎn)，刺激機(jī)體細(xì)胞免疫產(chǎn)生針對(duì)EBV相關(guān)抗原的特異性免疫應(yīng)答，通過(guò)特異性CTL介導(dǎo)的細(xì)胞毒活性從而識(shí)別和清除表達(dá)特定靶抗原的腫瘤細(xì)胞，達(dá)到治療目的。有學(xué)者以EBV核抗原3(EBNA3)抗原表位為基礎(chǔ)，研發(fā)出可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性CD8＋T免疫應(yīng)答的多肽疫苗，并進(jìn)行Ⅰ期臨床試驗(yàn)，結(jié)果顯示該疫苗能有效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生病毒特異性CD8＋T免疫應(yīng)答，從而展現(xiàn)出治療NPC等EBV相關(guān)惡性腫瘤的能力[34，35]。雖然目前關(guān)于EBV相關(guān)疫苗的研發(fā)獲得了一定的成果，但仍然有許多困難需要克服，比如除了現(xiàn)有的腫瘤標(biāo)志物之外，是否還有更好的靶點(diǎn)？另外，如何構(gòu)建和選取合適的動(dòng)物模型用于檢測(cè)疫苗的臨床應(yīng)用價(jià)值也是一個(gè)迫切需要解決的問(wèn)題[36]。

　　五、細(xì)胞信號(hào)通路抑制劑

　　LMP2A是靜息B細(xì)胞中唯一可檢測(cè)到的EBV潛伏期基因表達(dá)產(chǎn)物，其可增強(qiáng)細(xì)胞周期誘導(dǎo)和凋亡抑制等相關(guān)基因的表達(dá)，改變DNA和RNA新陳代謝相關(guān)基因表達(dá)。約50%的EBV相關(guān)胃癌LMP2A陽(yáng)性，而且LMP2A是NPC、淋巴瘤等腫瘤細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)的少數(shù)EBV保守抗原之一[2，37]。LMP2A可以通過(guò)調(diào)控SyK、Akt和mTOR等細(xì)胞信號(hào)通路介導(dǎo)B淋巴細(xì)胞的生存與增殖。因此，通過(guò)阻斷Syk、Akt等信號(hào)通路成為潛在的治療EBV相關(guān)腫瘤的重要靶點(diǎn)。例如，Syk的抑制劑R788(fostamatinibdisodium)和R406(freebase)等已經(jīng)在臨床前期試驗(yàn)以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中展現(xiàn)出良好的治療效果與潛力[38，39]。Akt抑制劑MK2206目前已開(kāi)展臨床試驗(yàn)用于檢測(cè)其治療NHL和HL的效果[2，40]。

　　隨著對(duì)于EBV感染以及EBV相關(guān)惡性疾病的發(fā)病機(jī)制的深入了解，使我們可以更加全面、透徹理解EBV與人體免疫系統(tǒng)之間的互動(dòng)關(guān)系，從而為EBV相關(guān)疾病和腫瘤的預(yù)防和治療，奠定了堅(jiān)實(shí)的理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。

　　同時(shí)需要重視的是EBV感染后所引發(fā)的相關(guān)疾病，比如IM、CAEBV、HLH以及淋巴瘤等LPD，在疾病發(fā)展過(guò)程中它們之間可相互轉(zhuǎn)化、互為因果或同時(shí)存在。另外，EBV感染與多種人類(lèi)惡性疾病發(fā)生和發(fā)展有著密切的關(guān)系，涉及的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，有的疾病預(yù)后極差、治療困難，所以對(duì)EBV感染相關(guān)疾病的早期診斷及隨診也很重要。

　　免疫治療尤其是細(xì)胞免疫治療，例如Vγ9Vδ2－T細(xì)胞和EBV－CTL，在前期研究或臨床試驗(yàn)中已展示出對(duì)EBV相關(guān)惡性疾病的良好治療效果和應(yīng)用潛力，但其安全性和有效性還需多中心大樣本的臨床隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步的評(píng)估和確認(rèn)。另外，如何聯(lián)合目前已有的免疫治療手段，建立新的聯(lián)合治療方案，進(jìn)一步提高抗腫瘤和抗病毒的治療效果，將會(huì)成為未來(lái)免疫治療發(fā)展的新趨勢(shì)。