H5亞型禽流感(如H5N1)是一種全世界范圍的人畜共患病，嚴(yán)重威脅著家禽產(chǎn)業(yè)以及人類的公共健康。對(duì)禽流感病毒進(jìn)行及時(shí)、定量和亞型檢測(cè)，是快速診斷和疾病防控的重要基礎(chǔ)。等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，尤其是環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)，使核酸擴(kuò)增可以在恒溫條件(60-65°C)下進(jìn)行，是對(duì)傳統(tǒng)PCR技術(shù)的重要改進(jìn)，尤其適用于條件欠發(fā)達(dá)地區(qū)以及現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。數(shù)字等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，通過將反應(yīng)體系分隔為大小均一的大量反應(yīng)單元，進(jìn)行獨(dú)立的單拷貝等溫?cái)U(kuò)增，并基于泊松分布，對(duì)起始模板數(shù)量進(jìn)行精確統(tǒng)計(jì)，在準(zhǔn)確性、靈敏度和絕對(duì)定量(不依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線)方面有了革命性的改進(jìn)，尤其適用于病毒載量的定量檢測(cè)。因而，開發(fā)適用于禽流感檢測(cè)的數(shù)字LAMP技術(shù)具有重要意義。

 

杜文斌課題組最近研發(fā)了一種界面打印液滴生成方法(Cross-interfaceEmulsification,XiE)(Xuetal.,2016,Anal.Chem.88:3171-3177)。其原理是利用穩(wěn)定流速注射液體的毛細(xì)管在油-氣界面處的高頻振動(dòng)，利用在油-氣界面的表面張力的周期性切割作用，實(shí)現(xiàn)均一液滴的制備。通過該方法，可快速連續(xù)生成大量皮升至納升體積微液滴，平鋪于96孔板容器底部形成液滴陣列。XiE技術(shù)不依賴于微加工技術(shù)，成本低、操作自動(dòng)化程度高，非常適合于實(shí)現(xiàn)數(shù)字核酸擴(kuò)增分析。前期的研究中，對(duì)基于XiE的數(shù)字等溫LAMP擴(kuò)增進(jìn)行了初步研究，表明這一系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)準(zhǔn)確的核酸定量檢測(cè)。在前期工作的基礎(chǔ)上，與中科院動(dòng)物研究所研究員何宏軒課題組合作，針對(duì)H5亞型的禽流感病毒的快速定量檢測(cè)，開展了模型驗(yàn)證和禽流感真實(shí)樣品的檢測(cè)。建立了特異性的H5亞型禽流感病毒LAMP檢測(cè)引物探針，首次驗(yàn)證了數(shù)字LAMP用于H5禽流感病毒檢測(cè)的特異性、靈敏度和線性范圍。研究結(jié)果表明，數(shù)字LAMP與實(shí)時(shí)熒光定量PCR，以及美國伯樂公司的QX200數(shù)字PCR系統(tǒng)的檢測(cè)靈敏度和線性一致，具有良好的特異性和準(zhǔn)確性。值得指出的是，相比于數(shù)字PCR和熒光定量PCR，數(shù)字LAMP表現(xiàn)出更好的抗抑制劑能力(如腐植酸、SDS等)，可以保證方法對(duì)沒有充分除去污染物的野外或臨床樣品檢測(cè)的可靠性。

 

AbsoluteQuantificationofH5-subtypeAvianInfluenzavirusesUsingDropletDigitalLoop-mediatedIsothermalAmplification

 

ABSTRACT

 

HumaninfectionwithavianinfluenzaAH5N1virusescancauseseverediseaseswithhighmortalityrate,andcontinuestoposeasignificantthreattoglobalpublichealth.Rapiddiagnosisisneededforidentifyingthetypesofinfluenzavirusesformakingtimelytreatmentdecisions.Here,wedemonstrateabsolutequantificationofH5-subtypeinfluenzavirusesbydigitalloop-mediatedisothermalamplification(dLAMP)onourrecentlydevelopedcross-interfaceemulsification(XiE)method.OurresultsshowthatXiE-baseddLAMPishighlyspecificanddisplayscomparablesensitivitytoreal-timePCR(qPCR)anddigitalPCR(dPCR).Notably,dLAMPismoretoleranttoinhibitorysubstancesthanPCRmethods,anddemonstratesimilardetectionefficiencytoqPCRforrealH5N1samples.Therefore,itcanserveasarobustandprecisealternativetoqPCRordPCR,andisespeciallysuitableforenvironmentalandclinicalsampleswithhard-to-removecontaminants.WebelievethatourdLAMPmethodoffersgreatpotentialforrapidandaccuratediagnosisofinfluenzaandotherinfectiousdiseases.